Pesquisa

Nos primeiros meses de execução do Projeto, as metodologias a serem utilizadas para isolamento, identificação das BRAs, sequenciamento do genoma completo de BRAs selecionadas e análise metagenômica serão testadas, validadas e padronizadas. Os laboratórios da Rede (que poderão ser Laboratórios Centrais de Saúde Pública – LACEN, Instituto Evandro Chagas (IEC), CETESB, da Rede Genômica da Fiocruz ou laboratórios das universidades participantes, a depender da cidade), terão seus profissionais capacitados para realização das análises. Com apoio dos Prestadores de Serviços de Saneamento (PSS) locais (parceiros do projeto) serão definidos os pontos de amostragem e elaborados protocolos para a coleta e transporte das amostras até o laboratório.

Coleta, preservação e transporte das amostras

Para a coleta das amostras, a Rede de Pesquisa ReViRAE contará com o apoio dos Prestadores de Serviços de Saneamento (PSS) locais, estes serão responsáveis, também, pelo transporte das amostras até os laboratórios cadastrados no projeto (LACEN ou UNIVERSIDADE).

O esgoto de cada ponto de amostragem será coletado por meio de amostragem composta, utilizando amostrador automático. A coleta composta terá duração de 24 horas nas ETEs, para a amostragem do esgoto dos hospitais o tempo de coleta será definido pelos parceiros. As amostras serão mantidas à temperatura entre 4°C e 8°C durante todo o período da coleta e transporte até os laboratórios para subsequente realização das análises.

As coletas serão realizadas com frequência mensal para isolamento e identificação das BRAs. O sequenciamento do genoma completo será realizado para as cepas de maior relevância, com base na avaliação da RAM fenotípica.

Para as análises metagenômicas, serão realizadas seis campanhas amostrais, ou seja, a cada dois meses.

Cultivo e identificação de BRAs e construção do
resistoma a partir do sequenciamento genômico
completo

A etapa de isolamento e identificação das BRAsserá realizada nos Laboratórios Centrais de Saúde Pública (LACEN) ou em laboratórios de apoio das Universidades Federais, a depender da cidade monitorada. O sequenciamento genômico completo de BRAs será realizado em laboratório da Coordenação de Vigilância Genômica da FIOCRUZ/RJ.

Para o isolamento de K. pneumoniae e E. coli será utilizada a técnica de concentração por membrana filtrante (42 mm por 142 mm de diâmetro, com porosidade de 0,45 µm). Estas membranas serão depositadas em meios de cultivo seletivos e diferenciais, meio KPC para isolamento/diferenciação de K. pneumoniae spp e ESBL para E. coli.

Após período de incubação, serão selecionadas até 5 colônias para repique em ágar nutriente com o intuito de promover o isolamento adequado das cepas. As colônias de Escherichia coli em meio ESBL são, normalmente, de coloração roxa, enquanto as colônias de Klebsiella pneumoniae em meio KPC possuem coloração verde. A coloração das colônias não é característica exclusiva dessas espécies bacterianas, entretanto, a coloração inicial já é uma forma de seleção das bactérias alvo.

Quando a cepa já estiver bem isolada, com aspecto morfológico homogêneo em toda placa, a mesma já pode ser enviada para detecção pelo MALDI-ToF em placas de Petri. As placas devem apresentar colônias isoladas, novas, com tempo de incubação próximo ao ideal para o crescimento dos micro-organismos. No caso de E. coli e K. pneumoniae, esse tempo seria de 24 horas.

As cepas isoladas e identificadas serão avaliadas quanto ao seu perfil de suscetibilidade antimicrobiana frente a um painel de drogas antimicrobianas de relevância sob o ponto de vista humano e àqueles preconizados pela Organização Mundial de Saúde (OMS), pelo método automatizado Vitek-2®. Os resultados serão interpretados de acordo com o BrCAST/EUCAST (Ano vigente), com controle de qualidade realizada através de MIC conforme orientação ditada nos guidelines acima especificados.

As cepas que apresentarem o perfil MDR (multirresistência para drogas de última geração/ Cefalosporinas de 3ª/4ª geração, Carbapenens e Fluoroquinolonas) serão submetidas ao sequenciamento do genoma completo (Whole Genome Sequencing –WGS) pela plataforma Illumina, pelo sequenciador MiSeq, estas deverão ser enviadas para FIOCRUZ/RJ.
Metagenômica comparativa para avaliação de comunidades microbianas e monitoramento dos genes de resistência aos antimicrobianos (resistoma) no esgoto

Uma abordagem metodológica inovadora de sequenciamento NGS por enriquecimento e hibridização de alta densidade será empregada para a determinação sensível e específica de comunidades clinicamente relevantes, entre bactérias, vírus e fungos (280 patógenos), com investigação concomitante de um painel de >2.000 genes/alelos de RAM. Para cada um dos 10 centros participantes, serão criteriosamente selecionados 3 sítios e cujas amostras serão monitoradas bimestralmente durante 12 meses, totalizando até 6 pontos de seguimento e até 180 amostras para as análises de metagenômica. O processamento, sequenciamento e análises dessas amostras serão realizadas pela Rede de Vigilância Genômica da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), representadas nesta proposta pela Fiocruz-RJ e Fiocruz-CE e seus parceiros em 6 capitais (RJ, CE, BA, AM, PE e MG)

Identificação e quantificação de antimicrobianos
e seus metabólitos

Algumas amostras de esgoto serão selecionadas para identificação e quantificação de resíduos de antimicrobianos e seus metabólitos. Serão identificados por meio do estabelecimento de etapas de extração e pré-concentração, seguido da análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas. Análises não-alvo (non-target) poderão ser implementadas para identificação de substâncias empregando-se sistemas de espectrometria de massas de alta-resolução, como Q-ToF, enquanto a quantificação de substâncias será realizada em sistemas do tipo triplo quadrupolo ou híbrido, quadrupolo/captura de íons.

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